Um kit de ferramentas de montagem de DNA para desbloquear o potencial CRISPR/Cas9 para engenharia metabólica

Biologia das Comunicações, volume 6, número do artigo: 858 (2023) Citar este artigo

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As tecnologias baseadas em CRISPR/Cas9 estão revolucionando a forma como projetamos células microbianas. Uma das principais vantagens do CRISPR no projeto de cepas é que ele permite a integração cromossômica de DNA livre de marcadores, eliminando procedimentos trabalhosos e muitas vezes ineficientes de recuperação de marcadores. Apesar dos benefícios, a montagem de sistemas de edição CRISPR/Cas9 ainda não é um processo simples, o que pode impedir seu uso e aplicações. Neste trabalho, identificamos algumas das principais limitações dos atuais kits de ferramentas Cas9 e projetamos melhorias com o objetivo de tornar as tecnologias CRISPR mais fáceis de acessar e implementar. Isso inclui 1) um sistema para alternar rapidamente entre construções de integração sem marcadores e baseadas em marcadores usando cepas de Escherichia coli padrão e que expressam Cre, 2) a capacidade de redirecionar cassetes de integração multigênica em loci genômicos alternativos por meio de troca baseada em Golden Gate de braços de homologia, 3) um método in vivo rápido e simples para guiar a montagem de sequências de RNA por meio de recombinação entre plasmídeos auxiliares Cas9 e oligonucleotídeos únicos. Combinamos essas metodologias com tecnologias bem estabelecidas em um kit de ferramentas abrangente para engenharia metabólica eficiente usando CRISPR/Cas9. Como prova de conceito, desenvolvemos o kit de ferramentas YaliCraft para Yarrowia lipolytica, que é composto por um conjunto básico de 147 plasmídeos e 7 módulos com finalidades diferentes. Utilizamos o kit de ferramentas para gerar e caracterizar uma biblioteca de 137 promotores e para construir uma cepa de novo sintetizando 373,8 mg/L de ácido homogentísico.

O desenvolvimento de tecnologias baseadas em CRISPR/Cas9 permitiu modificações genômicas rápidas, precisas e sem cicatrizes, o que mostra um grande potencial para design e bioprodução de cepas microbianas. Em particular, a engenharia metabólica de leveduras é uma das áreas de crescimento mais rápido na biologia da engenharia, permitindo a produção sustentável de produtos químicos, combustíveis, materiais, alimentos e produtos farmacêuticos1. Embora tenham o grande potencial metabólico das células eucarióticas, devido à sua natureza unicelular e ao rápido crescimento, as leveduras são mais fáceis de projetar e cultivar em escala.

Por conta disso, foram desenvolvidos sistemas CRISPR para leveduras2,3,4. Uma das vantagens mais importantes do CRISPR é que, devido à sua alta eficiência, permite modificações genômicas sem marcadores. Durante a engenharia tradicional de cepas, a eliminação de marcadores selecionáveis ​​do genoma, conhecida como recuperação de marcadores, é um gargalo comum5. Mesmo as culturas de leveduras de crescimento rápido requerem pelo menos cinco dias para a recuperação do marcador6, enquanto a própria transformação integrativa demora apenas dois ou três. Portanto, nos últimos anos, foram desenvolvidas várias técnicas de integração sem marcadores facilitadas pelo CRISPR6,7,8,9. Apesar destes desenvolvimentos, muitos projetos atuais de engenharia metabólica ainda dependem de abordagens baseadas em marcadores, o que pode limitar ou atrasar o sucesso na otimização de deformações. Neste trabalho, identificamos 3 melhorias nos sistemas CRISPR/Cas9 que podem facilitar o uso da engenharia de levedura baseada em Cas9, (1) a troca fácil entre modificações com e sem marcador (2) a troca rápida de braços de homologia para atingir diferentes integrações localizações e (3) um método fácil para clonar gRNAs.

Durante a integração sem marcadores baseada em CRISPR, o único fator seletivo é a quebra de fita dupla (DSB) induzida por Cas9. Para proliferar, as células precisam reparar esta lesão. Isto pode acontecer tanto pela utilização de um modelo (doador) que é integrado via recombinação homóloga (HR) ou por junção final não homóloga (NHEJ), ou seja, sem integração. A atividade do NHEJ é observada na maioria das espécies de fungos, incluindo a levedura de panificação Saccharomyces cerevisiae5,10. Em espécies onde o NHEJ é o mecanismo predominante, uma estratégia comum para aumentar a FC é deletar os genes NHEJ (KU70, KU80, POL4 e DNL4)11. Esta estratégia, embora melhore o RH, não evita totalmente a atividade indesejada do NHEJ12. Portanto, o isolamento de transformantes com modificações que levam a fenótipos de crescimento lento representa um problema geral com abordagens de integração sem marcadores. Isso ocorre porque os mutantes indel produzidos pelo NHEJ podem crescer demais e mascarar transformantes integrativos raros e de crescimento lento. Embora raramente sejam publicados esforços de engenharia malsucedidos, há um exemplo relacionado à ruptura do gene SDH5 em Yarrowia lipolytica. Apesar de múltiplas tentativas, esta modificação não foi isolada utilizando uma estratégia livre de marcadores baseada em CRISPR, enquanto a deleção bem sucedida foi obtida utilizando um marcador auxotrófico14. Observações semelhantes são amplamente comuns em trabalhos de engenharia de leveduras, onde muitas vezes alguns loci são mais fáceis de modificar do que outros, com alguns permanecendo sem sucesso - em parte devido à dificuldade de selecionar produtores lentos. Tais mutações com efeitos deletérios no crescimento celular são frequentes na engenharia metabólica15. Estudos de todo o genoma de S. cerevisiae revelaram que a superexpressão de 20% dos genes16 e a interrupção de 15% dos genes não essenciais17 afetam negativamente o crescimento celular. Além disso, a viabilidade celular pode ser afetada adversamente por interações epistáticas entre modificações em genes não alélicos . Portanto, abordagens de engenharia baseadas na integração livre de marcadores podem envolver casos ocasionais (mas difíceis de prever) em que é necessária uma seleção rigorosa baseada em um marcador auxotrófico. Nestes casos, seria necessário remontar uma nova cassete, atrasando significativamente o progresso. Uma melhoria desejada nos sistemas de integração assistidos por CRISPR/Cas9 seria, portanto, um método para reverter facilmente para a integração baseada em marcadores quando a tentativa sem marcadores falhar.